如何縮短熒光定量檢測(cè)的周期?

 

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本預(yù)處理優(yōu)化

 

樣本批量處理與標(biāo)準(zhǔn)化

 

集中樣本制備：將同類(lèi)樣本集中提取核酸/蛋白，減少反復(fù)開(kāi)機(jī)和試劑浪費(fèi)。例如使用96孔板或自動(dòng)化核酸提取儀（如磁珠法提取儀），單次處理多樣本，相比手工提取可縮短50%時(shí)間。

 

樣本質(zhì)量控制前置：提前用分光光度計(jì)（如NanoDrop）或電泳檢測(cè)樣本濃度與純度，避免因樣本降解導(dǎo)致的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

 

試劑預(yù)混與標(biāo)準(zhǔn)化體系

 

制備MasterMix：將PCR反應(yīng)液（如Taq酶、dNTP、緩沖液）按比例批量預(yù)混，減少單管配制誤差，同時(shí)避免多次開(kāi)蓋導(dǎo)致的污染，每批次可節(jié)省10-15分鐘。

 

使用即用型試劑盒：選擇包含預(yù)混液、引物探針的一體化試劑盒（如FastqPCRMasterMix），省去分步加樣步驟。

 

二、實(shí)驗(yàn)流程與技術(shù)參數(shù)優(yōu)化

 

熒光定量PCR技術(shù)改進(jìn)

 

選擇快速PCR儀：使用半導(dǎo)體加熱模塊的熒光定量PCR儀（如RocheLightCycler480），升溫速率可達(dá)5-10℃/s，相比傳統(tǒng)儀器（2-3℃/s）可縮短30%-50%反應(yīng)時(shí)間。例如，傳統(tǒng)40循環(huán)的反應(yīng)（約1.5小時(shí)）可壓縮至40-50分鐘。

 

優(yōu)化反應(yīng)程序：

 

縮短變性時(shí)間：若模板為cDNA，95℃變性時(shí)間可從30秒縮短至15秒（需驗(yàn)證特異性）。

 

采用“兩步法”PCR：將退火與延伸合并為一步（如60℃30秒），減少溫度循環(huán)次數(shù)，適合已知引物特異性的實(shí)驗(yàn)。

 

提高反應(yīng)效率：通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化引物濃度（如0.2-0.4μM）和鎂離子濃度（1.5-2.5mM），避免因參數(shù)不當(dāng)導(dǎo)致的擴(kuò)增效率低下（理想效率應(yīng)接近100%）。

 

多重?zé)晒舛繖z測(cè)

 

在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物和探針（如雙重或三重PCR），同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)，減少單樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)。例如，檢測(cè)食品中多種致病菌時(shí)，可將多個(gè)基因的引物探針混合，一次反應(yīng)完成檢測(cè)。

 

三、設(shè)備與自動(dòng)化工具應(yīng)用

 

自動(dòng)化液體處理設(shè)備

 

使用移液工作站（如TecanFreedomEVO）或自動(dòng)加樣儀，實(shí)現(xiàn)試劑分裝、樣本轉(zhuǎn)移的自動(dòng)化，避免手工操作的時(shí)間損耗（如96孔板加樣可從20分鐘縮短至5分鐘），同時(shí)降低人為誤差。

 

配備快速離心機(jī)，在樣本離心步驟（如核酸沉淀）使用高轉(zhuǎn)速（12,000rpm）縮短離心時(shí)間至1-2分鐘。

 

實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析工具

 

選擇自帶快速分析軟件的PCR儀（如AppliedBiosystemsQuantStudio系列），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后自動(dòng)生成Ct值、熔解曲線等結(jié)果，省去手動(dòng)分析時(shí)間。部分軟件支持實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)控，可提前判斷實(shí)驗(yàn)有效性（如無(wú)擴(kuò)增曲線時(shí)及時(shí)終止反應(yīng)）。

 

四、質(zhì)量控制與誤差預(yù)防

 

預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與體系優(yōu)化

 

提前通過(guò)梯度PCR確定最佳退火溫度和引物濃度，避免正式實(shí)驗(yàn)中因參數(shù)錯(cuò)誤導(dǎo)致的重復(fù)。例如，使用溫度梯度功能（如48-65℃）一次性測(cè)試12個(gè)溫度點(diǎn)，確定最優(yōu)條件。

 

設(shè)立陽(yáng)性/陰性對(duì)照，確保每批次實(shí)驗(yàn)的可靠性，避免結(jié)果無(wú)效導(dǎo)致的周期延長(zhǎng)。

 

耗材與試劑管理

 

使用薄壁PCR管或96孔光學(xué)反應(yīng)板，提高熱傳導(dǎo)效率，減少溫度傳遞時(shí)間。

 

試劑分裝保存于-20℃，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致的活性下降，確保反應(yīng)效率穩(wěn)定，減少因試劑失效導(dǎo)致的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

 

五、典型縮短周期案例

 

傳統(tǒng)流程：手工提取核酸（1小時(shí)）+手工配制反應(yīng)體系（20分鐘）+常規(guī)PCR儀反應(yīng)（1.5小時(shí)）+數(shù)據(jù)分析（10分鐘），總周期約2.5-3小時(shí)。

 

優(yōu)化后流程：自動(dòng)化核酸提取（30分鐘）+預(yù)混液快速配制（5分鐘）+快速PCR儀反應(yīng)（45分鐘）+實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析（5分鐘），總周期可縮短至1.5小時(shí)以內(nèi)。

 

總結(jié)

 

縮短熒光定量檢測(cè)周期的核心在于“自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、技術(shù)升級(jí)”：通過(guò)設(shè)備替代手工操作、優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)、整合多重檢測(cè)技術(shù)，可在保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的前提下大幅提升效率。若需極致縮短時(shí)間，可考慮搭配即時(shí)熒光定量技術(shù)（如等溫?cái)U(kuò)增+實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)），部分場(chǎng)景下可將周期壓縮至30分鐘內(nèi)（如POCT檢測(cè)）。